Свет

Биология связи, том 6, Номер статьи: 502 (2023) Цитировать эту статью

4854 Доступа

39 Альтметрика

Подробности о метриках

Световая флуоресцентная микроскопия изменила нашу способность визуализировать и количественно измерять биологические процессы быстро и в течение длительных периодов времени. В этом обзоре мы обсуждаем текущие и будущие разработки в области флуоресцентной микроскопии световых листов, которые, как мы ожидаем, еще больше расширят ее возможности. Сюда входят интеллектуальные и адаптивные схемы визуализации, позволяющие преодолеть традиционные компромиссы при визуализации, т. е. пространственно-временное разрешение, поле зрения и здоровье образца. В «умной» микроскопии микроскоп самостоятельно решает, где, когда, что и как отображать. Далее мы оцениваем, как методы восстановления изображений позволяют преодолеть эти компромиссы и как световые микроскопы с «открытым верхом» могут обеспечить мультимодальную визуализацию с высокой пропускной способностью. Таким образом, мы прогнозируем, что световая микроскопия будет играть важную роль в биомедицинской и клинической визуализации в будущем.

За последние десятилетия микроскопы предоставили нам бесценную информацию о том, как биологические процессы организованы в пространстве и времени. Основным нововведением стало селективное мечение белков и липидов флуоресцентными маркерами1,2, что позволило использовать такие методы флуоресцентной микроскопии, как световая флуоресцентная микроскопия (или для краткости световая микроскопия)3. Световая микроскопия позволяет нам визуализировать, количественно и динамически отслеживать структурные компоненты in vivo4,5,6 и in vitro7,8,9. Основы световой микроскопии рассмотрены в нескольких обзорах10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, но вкратце, она основана на ортогональном разделении путей освещения и обнаружения, что позволяет избирательно освещение всей плоскости изображения и одновременное широкопольное детектирование (рис. 1а).

Традиционная световая микроскопия, такая как трехобъективная микроскопия с селективным плоскостным освещением (SPIM), основана на ортогональном расположении освещения (синий; объективы освещения IL1 и IL2) и обнаружения (зеленый; объектив обнаружения DO). Это гарантирует, что осевое разрешение изображения в основном определяется толщиной светового листа (синий), что позволяет получать изображения больших образцов с широким полем обнаружения (зеленый) и хорошим оптическим срезом. Чтобы получить трехмерный объем, образец сканируется вдоль оси обнаружения либо путем перемещения самого образца, либо путем сканирования светового листа вместе с объективом на пути обнаружения. b – d Яркие примеры визуализации с помощью световых листов включают непрерывную долгосрочную визуализацию процессов развития эмбрионов мышей и рыбок данио, а также визуализацию очищенной ткани с субклеточным разрешением. b Кэти МакДоул и соавт.4 охарактеризовали клеточные движения, участвующие в развитии мышей, от ранней полоски (E6.5) до стадий сомитов (E8.5), визуализируя эмбрион мыши, экспрессирующий CAGTAG1, с помощью гистонового маркера (H2B-eGFP) в течение более 44 лет. час Масштабная линейка: 100 мкм. c Отдельные проекции из многопроекционной визуализации5 (три угла) растущей эмбриональной сосудистой сети рыбок данио, меченной флуоресцентным маркером сосудов (Tg(kdrl:EGFP), голубой) и маркером эритроцитов (Tg(GATA1a:dsRed), пурпурный) , изображения через 20 часов после оплодотворения (HPF) до 86 HPF. Масштабная линейка: 500 мкм d. Адам Глейзер и соавт.37 ​​выполнили крупномасштабную визуализацию расширенного среза почки размером 3,2 см × 2,1 см и толщиной 1 мм. Области интереса с высоким разрешением позволили выявить морфологию клубочков (шкала шкалы: 40 мкм), сосудов (шкала шкалы: 80 мкм) и канальцев (шкала шкалы: 50 мкм). Повышенное разрешение из-за расширения было дополнительно продемонстрировано при многоканальном увеличении ткани, окрашенной DAPI (шкала шкалы: 100 мкм [вверху] и 20 мкм [внизу]). Таким образом, масштабные линейки указывают размеры нативной нерасширенной ткани. Панель b была адаптирована с разрешения Кэти МакДоул и др. (2018)4. Панель c адаптирована из Daetwyler et al. (2019)5. Панель d адаптирована из Glaser et al. (2019)37.