Оценка методов экстракции для нецелевых метаболомических исследований для будущего применения в моделях заражения личинками рыбок данио

Том 13 научных докладов, Номер статьи: 7489 (2023) Цитировать эту статью

315 Доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Подготовка проб в нецелевой метаболомике должна обеспечивать воспроизводимую экстракцию как можно большего количества молекул. Таким образом, оптимизация подготовки проб имеет решающее значение. В этом исследовании сравнивались шесть различных процедур экстракции, чтобы найти наиболее подходящую для извлечения личинок рыбок данио в контексте модели инфекции. Были протестированы две однофазные экстракции с использованием метанола (I) и одной смешивающейся фазы метанол/ацетонитрил/вода (II) и два двухфазных метода с использованием разделения фаз между хлороформом и комбинациями метанола/воды (III и IV). Дополнительную гомогенизацию шариков использовали для методов III и IV (III_B и IV_B). Для оценки метода использовали девять внутренних стандартов и 59 представляющих интерес молекул (MoInt), связанных с микобактериальной инфекцией. Двухфазные методы (III и IV) привели к меньшему количеству признаков, более высоким площадям пиков MoInt, особенно аминокислот, и более высоким коэффициентам вариации по сравнению с однофазной экстракцией. Добавление гомогенизации шариков увеличило количество элементов, площади пиков и CV. Экстракция I показала более высокие площади пиков и более низкие CV, чем экстракция II, поэтому она является наиболее подходящим однофазным методом. Экстракция III и IV показала схожие результаты, при этом III было проще выполнить и менее подвержено неточностям. Таким образом, для будущих применений в метаболомике личинок рыбок данио и моделях инфекции можно выбрать экстракты I и III.

Целью метаболомики является аналитическое профилирование изменений молекул размером < 1500 Да (метаболом), присутствующих в организме или модельной системе в определенный момент времени1,2. Метаболом включает эндогенные метаболиты, а также метаболиты, происходящие из экзогенных источников, таких как лекарства. В то время как таргетные подходы основаны на количественном определении выбранных метаболитов, часто из определенной группы метаболитов, нецелевая метаболомика направлена ​​на обнаружение как можно большего количества метаболитов1,2,3. Часто применяемые аналитические методы разделения проб включают жидкостную хроматографию (ЖХ) и газовую хроматографию, которые регулярно сочетаются с масс-спектрометрией1,2,3. ЖХ-разделение при нецелевых подходах часто выполняется с использованием колонок с обращенной фазой для разделения неполярных метаболитов, колонок с нормальной фазой для разделения полярных метаболитов или колонок для жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC) в качестве вариаций колонок с нормальной фазой, в которых используются колонки с нормальной фазой. слой воды поверх их неподвижной фазы, что приводит к разделению, основанному в основном на разделении жидкость-жидкость. Колонки Phenyl-Hexyl — это колонки с обращенной фазой, обладающие уникальной селективностью в отношении ароматических молекул. После отделения метаболитов их ионизируют, обычно с использованием ионизации электрораспылением (ESI) или ионизации при атмосферном давлении, и анализируют с помощью масс-анализатора, часто Orbitrap или времяпролетных приборов1,2. Спектры фрагментации могут быть созданы в ходе того же анализа, например, с использованием сбора данных в зависимости от данных или независимого от данных, или в ходе последующего анализа. Сгенерированные таким образом данные затем могут быть дополнительно обработаны с использованием методов биоинформатики, таких как обнаружение пиков и предварительная обработка, с последующей многомерной статистикой для оценки и сравнения спектров фрагментации со справочными библиотеками для идентификации1,2,3,4,5.

Чтобы понять влияние заболеваний, например, туберкулеза6, и найти биомаркер для диагностики или успеха лечения, часто применяется метаболомика и наблюдается изменение метаболома хозяина. В частности, изменения эндогенного метаболома, возникающие в результате инфекции Mycobacterium Tuberculosis, тщательно изучались на людях4,5,6,7 и животных моделях8, включая мышей, морских свинок, кроликов и приматов, кроме человека9. Индуцированные изменения метаболома также изучали с использованием нетуберкулезной микобактерии M. marinum у личинок рыбок данио (Danio rerio, ZF) в качестве одного из ее естественных хозяев10. Такая модель ZF с использованием M. marinum напоминает гранулемоподобные структуры, обычно встречающиеся у ее аналогов у млекопитающих11,12,13,14. Геном ZF примерно на 70% идентичен человеческому15, и в нескольких исследованиях сообщалось о сходном с человеческим метаболизме, как в отношении метаболизма ксенобиотиков16,17,18,19, так и метаболома хозяина в случае инфекции20,21. Модель личинок ZF имеет дополнительные преимущества, в том числе простоту обращения, оптическую прозрачность эмбрионов и личинок, а также более низкие денежные затраты по сравнению с другими организмами22,23. Кроме того, эксперименты, проводимые с эмбрионами и личинками моложе 120 часов после оплодотворения (HPF), не считаются экспериментами на животных в Европейском Союзе (директива ЕС, 2010/63/EU)24. Из-за множества преимуществ исследования ZF с использованием нецелевой метаболомики в настоящее время становятся все более распространенными25,26, но редко используются в контексте заболеваний и, в частности, M. marinum20.